一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：1. 掌握凝膠過濾層析的原理，掌握凝膠柱柱效測定方法； 2. 熟悉凝膠層析的一般過程；
3. 了解凝膠介質(zhì)的選擇原則和應(yīng)用*域。 內(nèi)容：1. Sephadex G-50凝膠柱的裝填； 2. 凝膠柱柱效測定； 3．凝膠再生的方法。
二、實驗儀器和試劑 1. 實驗儀器
層析柱（1×40 cm），砝碼天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白質(zhì)檢測儀，記錄儀，滴頭吸管
2. 實驗材料和試劑
Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS緩沖液，5％丙酮（PBS緩沖液作為溶劑）
三、實驗步驟 清洗層析柱
測定層析柱的內(nèi)徑、高度，計算所需凝膠的體積
根據(jù)Sephadex G-50的膨脹體積，計算所需干凝膠的質(zhì)量
稱取相應(yīng)質(zhì)量的干凝膠，加入其總吸液量10倍的0.02 mol/L PBS 在100℃水浴中加熱溶脹1小時以上，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去 用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出 關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/4柱容積的洗脫液 （重復(fù)使用的填料，從此步開始）
邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降
等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉積 待沉積的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關(guān)閉出水口 通過2-3倍柱床體積的洗脫液使柱床穩(wěn)定(流速0.5～1 mL/min) 始終保護(hù)凝膠上端有一段液體
打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直**與膠面相切 沿管壁將5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免 將床面凝膠沖起 （參考完成時間11：30）
打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時收集流出液，當(dāng)樣品溶液流**與膠面相切時，夾緊下口夾子
按加樣操作，用1 mL洗脫液沖洗管壁2次
加入3－4 mL洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽 將層析柱進(jìn)水口連通
恒流泵，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測儀比色池進(jìn)液口相連，比色池出液口再與自動
部分收集器相連，用兩根導(dǎo)線將檢測儀與記錄儀連接起來，設(shè)置好基線的位置
洗脫時，打開上、下進(jìn)出口夾子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脫，記錄tr(記錄儀紙速設(shè)為12cm/h，電壓200mv；核酸蛋白監(jiān)測儀檢測波長254nm，靈敏度為0.1A)， 計算單位高度的柱效 （參考完成時間16：00）柱效計算公式：N = 5.54•［θr/( W 1/2)］2
其中，θr為平均洗脫時間，W 1/2為半峰寬。均為無因次特性值，測量時精確到1mm。 [Sephadex G-100每米理論塔板數(shù)為3000～6000]
四、注意事項
1. 各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。
2. 裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，**好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠。
3. 始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動。
4. 所用凝膠比較昂貴，需小心操作，實驗后回收，盡量避免浪費和損失。
五、演示
1. 在儀器使用前，shou先檢查檢測器，電源和記錄儀三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。
2. 接通記錄儀電源開關(guān)，使電源開關(guān)拔到“通”指示燈亮。可根據(jù)需要調(diào)換不同的走紙速度。記錄儀量程調(diào)在10mV檔上。
3. 將檢測儀波長旋鈕旋到所需波長刻度上，把量程旋鈕拔到100％T檔。
4. 按下檢測儀電源箱面板上的電源開關(guān)，此時記錄儀指針從零點開始向右移動某一刻度，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置5mV左右數(shù)字顯示為50左右。儀器開機(jī)穩(wěn)定時間大約在1小時左右，待基線平直后，可加樣測試。
5. 把檢測器進(jìn)樣口塑料膠管接到
部份收集器上，使層析柱中的洗脫液通過。透光率為“0”廠家巳調(diào)好，光密度A要調(diào)零，量程開關(guān)拔到100％T，調(diào)節(jié)光量旋鈕，使記錄儀指針在10mV數(shù)字顯示為100，即透光率為100%。把量程開關(guān)拔到“A”擋，緩慢調(diào)節(jié)A調(diào)零旋鈕，使檢測儀數(shù)字顯示為“0” ， 同時調(diào)節(jié)記錄儀零位旋紐使記錄儀指示在"0"位 。
6. 上述5個步驟結(jié)束后，就可以在層析柱上加樣。當(dāng)樣品經(jīng)層析柱分離，通過檢測后，就能通過記錄儀給出所需樣品吸收的圖譜。
7. 測試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池和尼龍管。
記錄儀光吸收A讀數(shù)
當(dāng)采用l0mV量程記錄儀時，記錄儀的滿量程讀數(shù)對應(yīng)于A量程開關(guān)所對應(yīng)的A讀數(shù)范圍。如A量程開關(guān)選定在0-0.**時，則記錄儀滿量程光吸收A讀數(shù)為0.5，當(dāng)記錄筆指示在記錄紙一半 (50%刻度)位置時即為0.2**。
數(shù)字顯示光吸收A讀數(shù)(可變量程讀數(shù)模式)
當(dāng)A量程開關(guān)選定在0-1.0A檔時，此時數(shù)顯板上顯示和讀數(shù)即為光吸收A的實際讀數(shù)，如顯示為080即表示為0.80A。
當(dāng)A量程開關(guān)切換在其它量程位置時，則數(shù)顯光吸收A讀數(shù)為: A量程選定在0-2.0檔時，數(shù)顯讀數(shù)×2=實際光吸收讀數(shù)A A量程選定在0-1.0檔肘，數(shù)顯讀數(shù)×1=實際光吸收讀數(shù)A #p#分頁標(biāo)題#e#
1.將“手/自”框內(nèi)的鍵置于自動狀態(tài)，按“定”和“停”;使定時時間為零，放開“停”按“快”或“慢”(“定”仍按著)**所需的定時時間，放開"慢"和“定”，再按一下"停"設(shè)定定時時間工作就完畢。若要查看設(shè)置時間，則只需按一下“定”鍵，就能顯示上一次所設(shè)時間，若要以秒顯示走時時刻，則需按下“秒”鍵。
2.定位，將“順/逆”鍵置于“順”或“逆”狀態(tài)，按“手動”鍵，使試管架轉(zhuǎn)**終點，這時報警器工作，報警指示燈亮，然后將“順/逆”鍵置于“逆”或 “順”狀態(tài)，本儀器就會自動地對準(zhǔn)**個試管(在 “順”狀態(tài)，**臂試臂為**外的那根。在“逆”狀態(tài)，**臂試管為**內(nèi)的那根)。如滴管口沒對準(zhǔn)**根試管只要松開換節(jié)臂調(diào)整螺釘，使滴臂口對準(zhǔn)**根試管即可。
七、背景資料
凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。相對分子質(zhì)量大的生物分子由于不能進(jìn)入或不能完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部的網(wǎng)孔，沿著凝膠顆粒間的空隙或大的網(wǎng)狀孔通過，大分子相對于小分子遷移的路徑短，保留值小，所以在層析過程中遷移速度**快，先從柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后從柱中流出。
凝膠層析常用于分離純化蛋白質(zhì)（包括酶類）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于樣品的濃縮和脫鹽及測定生物大分子的分子質(zhì)量等方面。以下對凝膠層析的使用進(jìn)行具體介紹。
圖1 凝膠層析的原理
（一） 層析柱
層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管,柱的直徑與長度根據(jù)經(jīng)驗，組別分離時，大多采用 20 -30cm 長的層析柱，分級分離時，一般需要 100cm 左右長的層析柱，其直徑在 1 -5cm 范圍內(nèi)，小于 1cm 產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于 5cm 則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。
由于層析柱的直徑大小不影響分離度，所以樣品量大時可用大直徑的層析柱 (一般制備用凝膠柱，直徑大于 2cm , 但在加樣時應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上 ) 。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過 1m。 ⑴ 分組分離時用短柱，一般凝膠柱長 20－30cm ，柱高與直徑的比較 5:1─10:1 ，樣品溶液體積應(yīng)小于 凝膠床體積為的 20% 。 ⑵ 分級分離時柱高與直徑之線為 20:1─100:1 （層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支撐濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的 1/1000 ），樣品溶液體積 應(yīng)小于 凝膠床體積為的 5 % 。 ⑶ 脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。適用的凝膠為 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱長與直徑之比為 5-15 ，樣品體積可達(dá)柱床體積的 20 — 25 % ，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。
（二）凝膠的類型
（三）凝膠的選擇
根據(jù)所需凝膠體積，估計所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的 2 倍，例如 Sephadex G-200 的吸水量為 20 ， 1 克 Sephadex G─200 吸水后形成的凝膠體積約 40mL 。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質(zhì)采用 100-200 號篩目的的 Sephadex G-200 效果好； 脫鹽用 Sephadex G-25 、 G-50 ，用粗粒，短柱，流速快。
（四）凝膠的制備
商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫**近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在 1-2 小時內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時， 自然膨脹需 24 小時**數(shù)天，而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。
（五）樣品溶液的處理
樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過 Sephadex G-15 短柱除去。樣品的粘度不能太大，否則影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。
（六）防止微生物的污染
交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有： #p#分頁標(biāo)題#e#
（1）疊氨鈉（ NaN3） 在凝膠層析中只要用 0.02 ％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶于水，在 20 ℃ 時約為 40 %。它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析特性，但可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。 （2）可樂酮 [Cl 3C-C(OH)(CH3)2 ] 在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02 % 。在微酸性溶液中它的殺菌效果**佳，在強堿性溶液中或溫度高于 60℃ 時易引起分解而失效。
（3）乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為 0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中**為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。
（4）苯基汞代鹽 在凝膠層析中使用濃度為 0.001%-0.01 %。在微堿性溶液中抑效果**佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。
除了直接加入抑菌劑，在位消毒 （Sanitization-in-place, SIP）和在位清（Cleaning-in-place，CIP）對層析介質(zhì)和儀器的保養(yǎng)十分重要。SIP的目的是將微生物感染減到**低，jue大多數(shù)的微生物可用0.5-1M NaOH以該凝膠的建議流速洗約0.5-1小時消除。CIP的目的是去除柱床內(nèi)沉淀的及頑固殘留的蛋白。凝膠在使用十次以后，**少做一次CIP。事實上，做CIP 時，往往已經(jīng)包含了SIP，不必再重復(fù)。新一代Bioprocess凝膠由于擁有很高的化學(xué)穩(wěn)定性，大都可用**1-2M NaOH在位清洗。BioProcess離子交換、疏水層析介質(zhì)以40cm/h, 用0.5-2M NaOH相反方向洗四個體積，再以**少3cv平衡緩沖液再生。凝膠過濾介質(zhì)CIP 的方法相同。但流速需減**20cm/h，接觸**少一**二小時。SOURCE介質(zhì)用二**五個柱體積1M NaCl、1M NaOH、1M HCl、1M NaCl 的順序以180cm/h 洗柱。每個溶液間需用二個柱體積蒸餾水過柱。去除脂類及疏水性強的蛋白, 使用遞增式梯度以4~10cv 70%乙醇或30%異丙醇洗柱，再用**少3cv蒸餾水加以過柱。或用2cv 0.5% 非離子性去污劑 [溶在1M乙酸中] 洗柱，再用五個柱體積70% 乙醇過過柱，**后用3～4cv蒸餾水加以清洗。
（六）凝膠回收
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用 70％、90％、95％乙醇脫水平衡**乙醇濃度達(dá) 90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
參考文獻(xiàn)
[1] **璞，林紅,朱濱.凝膠過濾層析實驗中Sephadex的溶脹與回收保存.實驗技術(shù)與管理,2006,23 (2):24-25.
